Bandenverbreiterung - vier Ursachen, die wir lösen können ✔️HPLC 👩🔬

Bandverbreiterung: dafür gibt es viele Gründe, und es ist wichtig, dass diese verstanden und das Phänomen auf ein Minimum beschränkt werden, damit die Anzahl der theoretischen Trennstufen in der Kolonne hoch ist.

Erste Ursache: Wirbeldiffusion

Die Säule ist mit kleinen Partikeln stationärer Phase gefüllt. Die mobile Phase passiert und transportiert die Probenmoleküle mit sich (Abbildung 2.2). Einige Moleküle haben Glück und verlassen die Säule vor den meisten anderen, nachdem sie zufällig in etwa gerader Linie durch das chromatographische Bett gereist sind. Andere Probenmoleküle verlassen später, nachdem sie auf dem Weg mehrere Umleitungen durchlaufen haben.

Zweite Ursache: Strömungsverteilung

Die mobile Phase strömt in einer laminaren Strömung zwischen den Partikeln der stationären Phase (Abbildung 2.3). Die Strömung ist im Zentrum des Kanals schneller als in der Nähe eines Partikels. Die Pfeile in Abbildung 2.3 stellen Geschwindigkeitsvektoren der mobilen Phase dar (je länger der Pfeil, desto größer die lokale Strömungsgeschwindigkeit). Wirbeldiffusion und Strömungsverteilung können reduziert werden, indem die Säule mit gleichmäßig großen Partikeln gefüllt wird.

Der erster Grundsatz worauf eine gute Kolumne basiert, ist das die Packung sollte aus Partikeln mit einer möglichst engen Größenverteilung bestehen. Das Verhältnis zwischen größtem und kleinstem Partikeldurchmesser sollte 2,0 nicht überschreiten, wobei 1,5 noch besser ist (Beispiel: kleinste Partikelgröße 5,0 mm, größte Partikelgröße 7,5 mm).

Die Verbreiterung durch Wirbeldiffusion und Strömungsverteilung wird durch die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase nicht oder nur wenig beeinflusst.

Dritte Ursache: Diffusion von Probenmolekülen in die mobile Phase

Probenmoleküle breiten sich ohne äußere Einwirkung im Lösungsmittel aus (so wie sich ein Zuckerklumpen auch ohne Rühren langsam in Wasser auflöst). Dies ist Längsdiffusion (Abbildung 2.4) und wirkt sich nur nachteilig auf die Plattenhöhe aus, wenn:
(a) kleine Partikel stationärer Phase,
(b) eine zu geringe Geschwindigkeit der mobilen Phase im Verhältnis zum Partikeldurchmesser, und
(c) ein relativ großer Probendiffusionskoeffizient fällt im Chromatographiesystem zusammen.

Das zweite Prinzip besteht darin, dass die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase so gewählt werden sollte, dass die Längsdiffusion keine nachteiligen Auswirkungen hat. Dies gilt, wenn u > 2Dm/dp, wobei u die lineare Strömungsgeschwindigkeit der mobilen Phase, Dm der Diffusionskoeffizient der Probe in der mobilen Phase und dp der Partikeldurchmesser ist.

Vierte Ursache: Stoffaustausch zwischen mobilen, 'stagnierenden mobilen',
und stationäre Phasen

Abbildung 2.5 zeigt die Porenstruktur eines Partikels mit stationärer Phase: Die Kanäle sind sowohl schmal als auch breit, einige verlaufen direkt durch das gesamte Partikel und andere sind verschlossen.

Die Poren sind mit mobiler Phase gefüllt, die sich nicht bewegt (sie stagniert). Ein Probenmolekül, das in eine Pore eintritt, wird nicht mehr vom Lösungsmittelfluss transportiert und ändert seine Position nur noch durch Diffusion. Es bieten sich jedoch zwei Möglichkeiten an:

(a) Das Molekül diffundiert zurück in die mobile Flussphase. Dieser Prozess braucht Zeit, in der sich Moleküle, die nicht in den Poren zurückgehalten wurden, etwas weiter bewegen. Die resultierende Bandenverbreiterung ist umso geringer, je kürzer die Poren sind, d.h. je kleiner die Partikel der stationären Phase sind. Außerdem ist die Diffusionsrate der Probenmoleküle in einem Lösungsmittel unter Bedingungen mit niedrigerer Viskosität größer (d. h. Sie diffundieren schneller in die Poren hinein und aus ihnen heraus) als in einem viskoseren Medium.

(b) Das Molekül wechselwirkt mit der stationären Phase selbst (Adsorbens oder Flüssigkeitsfilm) und wird adsorbiert. Für eine Weile bleibt es an der stationären Phase 'hängen' und geht dann wieder weiter. Auch dieser Stoffaustausch dauert ziemlich lange (Abbildung 2.6).

In beiden Fällen nimmt die Bandenverbreiterung mit zunehmender Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase zu: Die im bewegten Lösungsmittel verbleibenden Probenmoleküle werden umso weiter von den stagnierenden Molekülen entfernt, je schneller der Lösungsmittelfluss ist (aber es ist weniger Zeit für die Elution des gelösten Stoffs erforderlich).

• Der dritter Grundsatz sind das kleine Partikel oder solche mit einer dünnen, poröse Oberflächenschicht sollte als stationäre Phase verwendet werden.

• Der vierter Grundsatz ist das niedrigviskose Lösungsmittel sollten verwendet werden.

• Der fünftes Prinzip ist das hohe Analysegeschwindigkeit wird auf Kosten der Auflösung erreicht und umgekehrt.

Dieser Effekt ist jedoch bei kleineren Partikeln viel weniger ausgeprägt als bei größeren Partikeln.

Die theoretische Bodenhöhe H kann als Funktion der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase ausgedrückt werden, opt-in (Abbildung 2.7).1 Die H/u-Kurve wird auch als Van-Deemter-Kurve bezeichnet. Die optimale Durchflussmenge opt-in hängt von den Eigenschaften des Analyten ab.

Beiträge zur Bandenverbreiterung in der Chromatographie

Eine Möglichkeit, eine Trennung zu verbessern, besteht darin, die Höhe des theoretischen Bodens einer Kolonne zu verringern. Die Abbildungen berücksichtigen hier vier Beiträge zur Plattenhöhe: Variationen der Weglänge, Längsdiffusion, Stoffaustausch in der stationären Phase und Stoffaustausch in der mobilen Phase.

Der Effekt mehrerer Pfade auf die Bandverbreiterung eines gelösten Stoffes wird hier veranschaulicht. Das anfängliche Bandprofil des gelösten Stoffes ist rechteckig. Während sich dieses Band durch die Säule bewegt, nehmen einzelne gelöste Moleküle unterschiedliche Wege, von denen drei durch die mäanderförmigen farbigen Pfeile dargestellt sind. Die tatsächlichen Längen dieser Pfade sind durch die geraden Pfeile am unteren Rand der Abbildung dargestellt. Die meisten gelösten Moleküle durchlaufen Pfade mit ähnlichen Längen wie in Blau dargestellt, wobei einige viel kürzere Pfade (grün) oder viel längere Pfade (rot) zurücklegen. Infolgedessen ist das Bandprofil des gelösten Stoffes am Ende der Säule breiter und gaußförmig.

Der zweite Beitrag zur Bandenverbreiterung ist das Ergebnis der Längsdiffusion des gelösten Stoffes in der mobilen Phase. Gelöste Moleküle sind ständig in Bewegung und diffundieren von Regionen mit höherer Konzentration gelöster Stoffe in Regionen, in denen die Konzentration gelöster Stoffe geringer ist. Das Ergebnis ist eine Zunahme der Bandbreite des gelösten Stoffes, wie hier durch die beiden horizontalen Querschnitte durch die Säule und ihre entsprechenden Konzentrations-Abstands-Profile veranschaulicht, wobei (a) zeitlich früher liegt. Der rote Pfeil zeigt die Richtung an, in die sich die mobile Phase bewegt.

Wenn der gelöste Stoff die Säule passiert, bewegt er sich zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase. Wir nennen diese Bewegung zwischen Phasen Stoffaustausch. Wie hier dargestellt, tritt eine Bandenverbreiterung auf, wenn die Bewegung des gelösten Stoffes innerhalb der mobilen Phase oder innerhalb der stationären Phase nicht schnell genug ist, um eine Gleichgewichtsteilung des gelösten Stoffes zwischen den beiden Phasen aufrechtzuerhalten: (a) ideale gaußsche Gleichgewichtsprofile für den gelösten Stoff in der mobilen Phase und in der stationären Phase; (b, c) Die Bewegung des Bandes des gelösten Stoffes mit der mobilen Phase stört dieses Gleichgewicht und, wie durch die roten Pfeile angedeutet, den gelösten Stoff am stärksten von der stationären Phase in die mobile Phase und von der mobilen Phase in die stationäre Phase, um das Gleichgewicht wiederherzustellen; (d) einmal das Gleichgewicht ist wiederhergestellt, das Band des gelösten Stoffes ist jetzt breiter.

Die Höhe einer theoretischen Platte, H, ist eine Summe der Beiträge von jedem der vier Beiträge zur Bandverbreiterung. Wie hier gezeigt, H ist eine komplizierte Funktion der Flussrate der mobilen Phase, u,

H = A + B/u + Cu

dies ist auch als Van-Deemter-Gleichung bekannt.

In der Van-Deemter-Gleichung, A berücksichtigt den Beitrag mehrerer Pfade, B/u für den Beitrag der Längsdiffusion und Cu für den kombinierten Beitrag des Stoffaustauschs in der stationären Phase und der mobilen Phase.

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