Prinzip und Ablauf der Affinitätschromatographie

Was ist Affinitätschromatographie?

Affinitätschromatographie ist eine Form der Flüssigkeitschromatographie, mit der Analyten auf spezifische Weise isoliert und gereinigt werden. Es verwendet eine reversible biologische Wechselwirkung, die Affinität genannt wird und sich auf die erzwungene Anziehung bezieht, die zwischen den Atomen in verschiedenen Graden angewendet wird, wodurch sie in Kombination bleiben.

Prinzip der Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie ist eine der vielseitigsten und effektivsten chromatographischen Methoden zur Trennung eines komplexen Gemisches aus einer einzelnen oder einer Gruppe von Komponenten. Es basiert auf sehr präzisen biologischen Wechselwirkungen zwischen zwei Komponenten, wie Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Antikörpern und Antigenen oder Rezeptor und Ligand. Diese typischerweise reversiblen Wechselwirkungen werden zur Reinigung verwendet, bei der Moleküle, die als Molekül bekannt sind, auf eine feste Matrix gelegt werden, um eine stationäre Phase zu bilden, während sich Komponenten in der mobilen Phase befinden. Viele der weit verbreiteten Liganden sind mit Matrizen assoziiert, die jetzt kommerziell verfügbar und gebrauchsfertig sind.Die stationäre Phase besteht aus einem Trägermedium, an das das Substrat sympathisch gebunden ist, um die für die Bindung des Zielmoleküls notwendigen reaktiven Gruppen aufzudecken. Während das rohe Probengemisch von Molekülen durch die Säule bewegt wird, binden in der stationären Phase Moleküle mit einer Bindungsstelle an die stationäre Phase, während alle anderen Substanzen im Hohlraumvolumen der Chromatographiesäule eluiert werden. Sobald andere Moleküle von der Säule eluiert sind, können die gebundenen Zielmoleküle überwunden werden, indem ein konkurrierender Ligand in die mobile Phase eingeschlossen wird oder indem der pH-Wert, die Ionenstärke oder der Polaritätszustand geändert werden.

Affinitätschromatographie-Verfahren

Bevor wir mit einem Affinitätschromatographieexperiment beginnen, müssen wir die verschiedenen Komponenten erkennen, die für die Durchführung des Prozesses wesentlich sind.

Matrix: Es ist ein passiver Träger, der direkt oder indirekt an einen Liganden gebunden sein kann.

Distanzarm: Durch die Eliminierung jeglicher satirischer Hinderniseffekte wird es verwendet, um die Bindung zwischen Ligand und Zielmolekül zu verbessern.

Ligand: Es bezieht sich auf eine Komponente, die gegenüber einem bestimmten Zielmolekül bindet.

Versuchsdurchführung der Affinitätschromatographie

Säulenvorbereitung:

1. Spülen Sie die Säule und die stationäre Phase mit der Pufferlösung, um den Liganden für die Bindung vorzubereiten.
2. Füllen Sie die Säule mit festen Trägern wie Agarose, Safarose und Cellulose usw.
3. Wählen Sie den Liganden entsprechend der gewünschten Trennung aus.
4. Befestigen Sie den Abstandshalterarm zwischen dem Liganden und dem festen Träger.

Probenbeladung:

1. Gießen Sie eine Probenmischung in eine Säule und lassen Sie sie mit kontrollierter Geschwindigkeit laufen.

Elution von Ligandenmolekülen:

1. Die gewünschte Komponente wird zurückgewonnen, indem günstige Bedingungen für die Haftung gebundener Moleküle eingestellt werden.

Affinitätschromatographie-Anwendungen

• Für alle biologischen Makromolekültrennungen und -reinigungen wird Affinitätschromatographie verwendet.
• Es wird zur Reinigung von Antikörpern, Nukleinsäuren und Enzymen verwendet.
• Es wird auch verwendet, um die Menge einer Substanz in einer komplexen Mischung zu verringern.
• Affinitätschromatographie wird verwendet, um festzustellen, welche biologischen Verbindungen an eine bestimmte Substanz binden.
• Die Affinitätschromatographie wird in der klinischen Anwendung eingesetzt.
• Eine weitere Anwendung der Affinitätschromatographie in der analytischen Chemie ist ein Werkzeug zur Untersuchung der Kinetik biologischer Wechselwirkungen.

Die Vorteile der Affinitätschromatographie sind wie folgt.

• Zielmoleküle können durch Affinitätschromatographie in einem hochgereinigten Zustand erhalten werden.
• Es kann verwendet werden, um bestimmte Verunreinigungen zu extrahieren.
• Affinitätschromatographie hat eine höhere Empfindlichkeit als FID und FCD.
• Affinitätschromatographie wird bei der Impfstoffherstellung eingesetzt.
• Affinitätschromatographie liefert einen hohen Reinheitsgrad.
• Es wird bei der Herstellung von Impfstoffen in der pharmazeutischen Herstellung verwendet, um die Produktqualität zu verbessern.
• Es hängt nicht von der Temperatur, der Pufferzusammensetzung, dem pH-Wert und der Ionenstärke ab.
• Zur Verbesserung der Löslichkeit wird die Affinitätschromatographie eingesetzt.
• Hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu TCD &Ampere; FID.
• Affinitätschromatographie wird bei der Herstellung von Impfstoffen eingesetzt.
• Affinitätschromatographie wird bei der Reinigung von Proteinen und Enzymen verwendet.
• Affinitätschromatographie ergibt eine hohe Spezifität.
• Enzyme und andere Proteine werden durch Affinitätschromatographie untersucht.
• Um die Qualität des Produkts zu erhalten, wird diese Chromatographie beim Pharmahersteller bei der Herstellung von Impfstoffen eingesetzt.
• Die Affinitätschromatographie ist nicht auf Ionenstärke, pH-Wert, Temperatur und Zusammensetzung des Puffers angewiesen.
• Der hohe Reinheitsgrad kann durch Affinitätschromatographie erhalten werden.
• Dies ist ein sehr reproduzierbarer Prozess.
• Dies ist die Vereinfachungsmethode.
• Wird verwendet, um die Löslichkeit zu erhöhen.
• In der Gentechnik wird Affinitätschromatographie verwendet.

Die Nachteile der Affinitätschromatographie sind wie folgt.

• Es braucht viel Geschick, um das zu tun.
• Dies ist im Vergleich zu anderen Chromatographietechniken unspezifisch für die Adsorption.
• Die bei dieser Chromatographie verwendeten Liganden sind teuer.
• Manchmal treten bei der Affinitätschromatographie Ligandenlecks auf.
• Metallionenübertragung und Leckage führen zu Proteinverlust.
• Es erfordert viel Geschick, damit umzugehen.
• Es stört die Struktur.
• Übertragung und das Austreten von Metallionen führen zu Proteinverlust.
• Manchmal wird eine Leckage von Liganden beobachtet.
• Das Volumen der Probe ist begrenzt.
• Das verwendete Trägergas muss rein sein, beispielsweise reiner Stickstoff.
• Die in der Affinitätschromatographie verwendeten Liganden sind teuer.
• Relativ geringe Produktivität.
• Es hat eine unspezifische Adsorption.
• Abbau des festen Trägers.
• Metallionenübertragung und Metallionenleckage führen zu Proteinverlust.
• Die Affinitätschromatographie ist für die Adsorption unspezifischer als andere Chromatographiemethoden.

Häufig gestellte Fragen zur Affinitätschromatographie lauten wie folgt.

• Was ist Affinitätschromatographie? Affinitätschromatographie ist eine Technik zur Trennung und Analyse von Biomolekülen basierend auf ihren Strukturen oder biologischen Funktionen. Es ist eine bedeutende und nützliche Trennmethode in der Biochemie, Biotechnologie, Umweltwissenschaften und Pharmazeutik.

• Was ist das Grundprinzip der Affinitätschromatographie? Das Grundprinzip der Affinitätschromatographie besteht darin, dass ein biospezifischer Ligand an eine stationäre Phase oder ein Harz der Säulenmatrix, wie Agarose oder Cellulose, immobilisiert ist.

• Welche Art von Chromatographie ist eine Affinitätschromatographie? Affinitätschromatographie ist eine Art Flüssigkeitschromatographie, die zur Reinigung spezifischer Biomoleküle, einschließlich Proteinen, verwendet wird.
  Was ist der Hauptvorteil der Affinitätschromatographie? Der große Vorteil der Affinitätschromatographie besteht darin, dass sie eine sehr hohe Spezifität und einen hohen Reinheitsgrad erreichen kann.

• Was ist der Hauptunterschied zwischen Affinitäts- und Ionenaustauschchromatographie? Der Hauptunterschied zwischen Affinitäts- und Ionenaustauschchromatographie besteht darin, dass Affinitätschromatographie verwendet wird, um geladene oder ungeladene Moleküle zu trennen, während Ionenaustauschchromatographie verwendet wird, um geladene Moleküle zu trennen.

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