HPLC-Prinzip und Arten der HPLC-Chromatographie

Einführung in die HPLC:
HPLC ist eine Technik, die zur Trennung, Identifizierung, quantitativen und qualitativen Analyse jedes Moleküls in der Probe verwendet wird, abhängig von seiner Wechselwirkung mit der stationären Phase und Polarität. Pumpe durchströmt eine mobile Phase mit hohem Druck mit dem Probengemisch durch eine Säule und ermöglicht eine bessere Trennung, daher wird es auch als Hochdruckflüssigkeitschromatographie bezeichnet. Jedes Molekül der Probe interagiert geringfügig mit dem Adsorptionsmaterial, wobei das Molekül, das stark mit der stationären Phase interagiert, die Säule langsamer durchläuft als ein Molekül mit geringer Wechselwirkung. dieser Unterschied bewirkt die Trennrate der verschiedenen Analyten.

Die Arten der HPLC-Chromatographie sind wie folgt:

Normalphasenchromatographie:
Bei dieser Art der Chromatographie werden die mäßig polare mobile Phase und die polare stationäre Phase zur Trennung der in Moderatorlösungsmitteln frei löslichen Analyten verwendet. Die Verwendung polarerer Lösungsmittel in der mobilen Phase verringert die Retentionszeit (RT) von Analyten. Bei der NP-Chromatographie eluieren weniger polare Analyten zuerst als die polaren Analyten. Die NP-Chromatographie eignet sich besser für die Trennung von Analyten, die sich in der Anzahl der funktionellen Gruppen unterscheiden. Es wird zur Proteintrennung verwendet.
Umkehrphasenchromatographie:
Dies ist eine wichtige Analysetechnik, die üblicherweise verwendet wird, bei dieser Methode werden Analyten auf der Basis der Polarität getrennt. Die unpolare stationäre Phase und die polare mobile Phase werden in der RP-Chromatographie verwendet. Die Retentionszeit ist für Analyten, die unpolarer sind, länger, während polare Analyten leichter eluieren. Je hydrophober der Analyt ist, desto stärker bindet er an die Säule und desto höher ist die Konzentration des organischen Lösungsmittels, die zur Elution des Analyten erforderlich ist. Die RP-Chromatographie ist am beliebtesten, weil sie für die breite Palette von Molekülen gilt. Es kann nicht für die Proteine gelten, da das organische Lösungsmittel die Denaturierung von Proteinen verursacht.

SE-Chromatographie- oder Gelfiltrationschromatographietechnik wird angewendet, um die Partikel auf der Grundlage der Größe zu trennen. Die großen Moleküle fließen schnell durch die Säule als die kleineren Moleküle, die SE-Chromatographie ist eine nicht absorbierende Wechselwirkung mit den Proben. Dies ist eine wichtige Analysetechnik zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen sowie Polysacchariden.
Ionenaustauschchromatographie:
Diese Methode ist am nützlichsten für die Analyse von Wasser, Proteinreinigung. Es trennt die polaren Moleküle und Ionen aufgrund der Ähnlichkeit mit dem Ionenaustauscher. Es wird für jede Art von geladenen Molekülen verwendet. Ionenaustauschchromatographie hat zwei Arten, Kationen- und Anionenchromatographie. Die Kationenaustauschchromatographie enthält das positiv geladene und die Anionenaustauschchromatographie ein Anion mit der positiv geladenen funktionellen Gruppe.

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