Methodenentwicklung mittels HPLC

Methodenentwicklung ist das Verfahren zur Bestätigung, dass eine Analysemethode für die Anwendung im Forschungslabor zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Proben geeignet ist. Analysemethoden müssen im GLP- und GMP-Umfeld angewendet und mit den Akzeptanzkriterien und Protokollen gemäß den Richtlinien von ICH entwickelt werden.Bei der Entwicklung der Analysemethode müssen Sie einige Dinge beachten, z. B. die Entwicklung einer möglichst einfachen Analysemethode, die nicht kompliziert ist, die Verwendung der gängigsten Lösungsmittel und der stationären Phase in HPLC-Qualität, die Entwicklung einer kosten- und zeitsparenden Methode.

Vor Beginn der Methodenentwicklung am HPLC-Instrument.

• Verwenden Sie immer Lösungsmittel in HPLC-Qualität.
• Filtriere die mobile Phase durch einen 0,45 μ Nylonmembranfilter.
• Filtrieren Sie die Probe durch einen 0,2 μ Nylonmembranfilter.
• Beschallen Sie die mobile Phase und die Proben, um gelöste Gase zu entfernen.
• Spülen Sie den gesamten Lösungsmittelbehälter und spülen Sie den Autosampler, um Luftblasen zu entfernen, und ersetzen Sie die Lösungsmittel.
• Stellen Sie den gewünschten Parameter im System ein.
• Konditionieren Sie die Säule ausreichend lange mit einer mobilen Phase.
• Überprüfen Sie den Säulendruck, er sollte minimal sein.
• Starten Sie die Analyse.
• Integrieren und Behalten Sie die Daten

So starten Sie die Methodenentwicklung in der HPLC

1. Art der Probe (chemische und physikalische Eigenschaften der Probe)
2. Anzahl der vorhandenen Verbindungen
3. Struktur des Analyten
4. pKa-Wert
5. löslichkeit des Analyten
6. Molekulargewicht
7. UV-Spektrum (λ max.)
8. Auswahl der HPLC-Methode, Anfangsbedingungen und Optimierung.

• Umkehrphasen-HPLC - Verwendung von Wasser, dem organischen Lösungsmittel als Laufmittel, Säule C18, C8, Phenyl, TMS und Cyano.

Primäre Option für die Mehrzahl der Proben, insbesondere neutrale und nicht ionisierte Verbindungen, die in Wasser und organischen Gemischen löslich sind.

• Ionenpaar-HPLC - Verwendung von Wasser, dem organischen Lösungsmittel als mobile Phase, Puffer zur Kontrolle des pH-Werts und als Ionenpaar-Reagenz. Spalte C18, C8 und Cyano.

Eine geeignete Option für die ionischen/ionisierbaren Verbindungen sind insbesondere Basen/Kationen.

• Normalphasen-HPLC - mobile Phase sind als Gemisch organischer Lösungsmittel, Säulen Cyano, Diol, Amino, Kieselsäure.

Nächste Option, während Reverse Phase und Ionenpaar-HPLC nicht funktionieren, primäre Option für Proben von lipophilen, die nicht gut in Wasser und organischen Gemischen löslich sind, primäre Option für Kombinationen von Isomeren.Abgesehen vom theoretischen Teil sollten Sie in der Literatur nachsehen, ob es bereits Methoden für dieselbe oder eine ähnliche Probe gibt. Sie müssen Zeitschriften mit Nachschlagewerken für HPLC-Methoden überprüfen.

Bei der Entwicklung der HPLC-Methode folgen Sie den ICH-Richtlinien wie Tailing-Faktor, Asymmetriefaktor, Auflösung, Kapazitätsfaktor, theoretische Bodennummer. Sie sollten es während der Methodenentwicklung mit Methanol und Wasser versuchen oder je nach Löslichkeit Ihrer Probe mit 50% beginnen und je nach Peak-Retention können Sie den Prozentsatz der mobilen Phase ändern, bis Sie den Sharpe-Peak erhalten. Wenn der Peak nicht in der mobilen Phase von Methanol / Acetonitril / Wasser zurückgehalten wird, können Sie danach Puffer verwenden.

Es sollte Phosphat oder Acetat sein. Phosphatpuffer hat üblicherweise einen Puffer für seine einfache Verfügbarkeit und seinen PKa-Wert verwendet. Phosphatpuffer ist stabil und sorgt für die zusätzliche hydrophile Wirkung.Puffer werden verwendet, wenn Sie ionisierbare Analyten mit Umkehrphasenchromatographie analysieren und den pH-Wert der mobilen Phase stabil halten. Sobald Sie eine bessere Spitzenform erhalten, gehen Sie danach für Spitzenschärfe.

Denken Sie daran, dass die Methode wirtschaftlich und zeitsparend sein sollte.Die Peakform sollte im Bereich der ICH-Richtlinien für Tailing-Faktor, Asymmetriefaktor, Auflösung, Kapazitätsfaktor, theoretische Bodenzahl, Peak liegen response.It es ist eine herausfordernde Aufgabe, logisch zu sein, bevor Parameter nach der Methodenentwicklung geändert werden. Die Methodenvalidierung sollte gemäß den Richtlinien von ICH durchgeführt werden.

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