¿Was ist das Prinzip der HPLC?

HPLC ist eine analytische und auch eine präparative Technik, bei der eine Flüssigkeit durch ein Bett aus sehr fein gepackten Partikeln gepumpt wird. Die Analyten in der mobilen Phase interagieren mit den chemischen Gruppen auf den Partikeln. Einige Analyten haben eine höhere Affinität als andere für die stationären Partikel und ermöglichen somit die Trennung der verschiedenen Analyten. Die Anfänge der HPLC gehen auf die 60er Jahre zurück, als Jim Waters einen Brechungsindexdetektor für Dow Chemicals entwarf, um an der Trennung von Polymeren zu arbeiten. Diese Trennung erfolgte unter Verwendung von Gelen, um die Molekülgrößen verschiedener Polymere zu trennen.

Im Laufe der Jahre wurden viele neue Modi der Chromatographie erfunden, nämlich:

Normalphasenchromatographie

Umkehrphasenchromatographie

Ionenaustausch

CPC (Zentrifugale Verteilungschromatographie).

Typischer HPLC einfacher isokratischer Aufbau.

Bei der Normalphasenchromatographie werden polare Partikel, üblicherweise Kieselsäure, als stationäre Phase und unpolare Lösungsmittel wie Hexan, Ethylacetat, n-Butanol und Methanol in aufsteigender Reihenfolge verwendet. Das Hauptmerkmal der Trennung ist hier hauptsächlich die Polarität bestimmter Gruppen an den Molekülen.

Die Umkehrphasenchromatographie fand in den 70er Jahren statt, als Chemiker einige hydrophobe Ketten zuerst C8 und dann C18 (eine Kette von 18 Kohlenstoffatomen lang) auf den Kieselsäureteilchen installieren konnten. Wenn die Kohlenstoffbeladung ausreicht, werden die Eigenschaften vollständig geändert, die Säule wird unpolar oder hydrophob. Die verwendete mobile Phase ist jetzt eine sehr polare wie Wasser, Methanol, Acetonitrilisopropanol. Dies wird als Umkehrphase bezeichnet, da es genau umgekehrt zur Normalphasenchromatographie ist. Die meisten HPLC-Trennungen (über 90%) sind heute RP-HPLC.

Typische Trennung komplexer Moleküle.

Ionenaustauschchromatographie wird verwendet, um Analyten hauptsächlich aufgrund ihrer Ladung zu trennen, wir können anionische oder kationische Austauschersäulen haben, die für die Ionenchromatographie verwendet wurden.

Bestimmte wichtige organische Moleküle wie Aminosäuren werden oft mit dieser Technik gemessen. Hitachi ist nach wie vor der Hauptlieferant dieses als Komplettsystem verpackten Instruments.

CPC (Zentrifugale Verteilungschromatographie)

Es ist eine andere Form der Chromatographie, bei der die stationäre Phase ebenfalls flüssig ist, aber mit Zentrifugalkraft an Ort und Stelle gehalten wird. Das Prinzip bleibt gleich, es ist immer noch und Austausch von Analyten nach ihrem Verteilungskoeffizienten in den 2 nicht mischbaren Flüssigkeiten.

Diese Form der Chromatographie wird hauptsächlich von Personen verwendet, die eine Reinigung von Biomolekülen (Antioxidantien, Flavenoide, Anthocyane usw.) durchführen möchten

Das Schöne ist, dass Trennungen von mehreren Gramm in weniger als einer Stunde und sehr reproduzierbar durchgeführt werden können, ohne dass teure Präparationssäulen erforderlich sind. Einige industrielle Anlagen ermöglichen die kontinuierliche Reinigung von kiloweise Substanzen.

Es wurde mit großem Erfolg verwendet, um den Cannabinoidgehalt von Cannabis zu trennen, nämlich die 2 Hauptformen THC und CBD.

Üblicher Detektor, der verwendet wurde, war hauptsächlich einfacher UV-Detektor. Wir haben jetzt viele Detektoren mit stark verbesserten Empfindlichkeiten und Selektivitäten wie:

RI-Brechungsindexdetektor für nicht chromophere Substanzen

ELSD (evaporativer Lichtstreudetektor) ist nützlicher als ein RI-Detektor, benötigt jedoch Lösungsmittel, das leicht zerstäubt werden kann und nur kein Salz oder flüchtige Salze verwendet, da sonst eine starke Salzansammlung im Detektor auftritt.

DAD-Diodenarray-Detektor, der es ermöglicht, den gesamten Analyten in einem ziemlich weiten Wellenlängenbereich von niedrig UV bis sichtbar zu betrachten.

Elektrochemische EC-Detektoren hochempfindlich, aber schwer zu bedienen.

Fluoreszenzdetektion, bei der das Molekül bei einer Wellenlänge angeregt und bei einer höheren detektiert wird, sehr empfindlicher und spezifischer Detektor.

MS der Massenspektroskopie, bei der die Kosten für diesen Detektor ein Mehrfaches der Kosten für den Rest der Instrumentierung betragen können. Es ist ein sehr sensibles und komplexes Instrument, das einen hochqualifizierten Techniker und eine große Forschungsgruppe benötigt, um die notwendigen Mittel bereitzustellen, um es in gutem Zustand zu halten. Seine Nutzungsgeschwindigkeit erlaubt es jedoch, Hunderte von Analysen an einem Tag zu analysieren.

Dies ist nur eine sehr kurze Einführung, dieses Thema hat Tausende von Büchern. RP-Phasensäulen werden von vielen Unternehmen hergestellt, was zu einigen tausend Modellen führt. Trennungsbanken existieren, um Anfängern die Arbeit zu erleichtern.

Bitte beachten Sie, dass die Partikel so fein sind und auch der Durchmesser der Schläuche, dass der Bediener alle zu analysierenden Elutionsmittel und Proben durch 0,45 Mikron und vorzugsweise 0,22 Mikron filtern muss. Andernfalls führt dies zu Verstopfungen der Ausrüstung mit teuren Reparaturen. Du wurdest gewarnt!

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