Pufferauswahl bei der Entwicklung von HPLC-Methoden

Die Herstellung einer wässrigen mobilen Phase ist die wichtigste Stufe der RP-HPLC-Methodenentwicklung für ionische Moleküle. Dies beinhaltet eine Betrachtung der Auswirkungen des pH-Werts auf die Retentionszeit einer Komponente, Konzentration und Art des Puffers, Löslichkeit und seine Auswirkung auf den Nachweis.

Eine ungeeignete Auswahl des Puffers in Bezug auf pH-Wert, Ionenstärke und Pufferspezies kann zu Rückständen und nicht reproduzierbarer Retentionszeit von polaren und ionisierenden Verbindungen bei der Umkehrphasentrennung führen.

Komplexitäten wie Wechselwirkungen zwischen Molekülen und partieller Ionisation, Molekülen und anderen aktiven Zentren an stationären Phasen können durch Auswahl des geeigneten Puffers, seiner korrekten Ionenspezies und Ionenstärke in der mobilen Phase überwunden werden. Bei Trennungen LC-MS, die zu sehr auf die richtige Wahl von Säure, Base, Pufferspezies und anderen Additiven angewiesen sind, muss ein Puffer basierend auf seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Ionisierung des Moleküls an der MS-Grenzfläche zu unterdrücken und nicht zu hemmen.

Die Retentionszeit ionischer Komponenten in der Umkehrphasenchromatographie wird grundlegend vom pH-Wert der mobilen Phase beeinflusst. Die RT von nichtionischen Komponenten wird minimal durch den pH-Wert der mobilen Phase beeinflusst.Puffer ist eine Lösung einer schwachen Base und ihrer konjugierten Säure oder einer schwachen Säure und ihrer konjugierten Base.

Sie reduzieren die Wirkung von Hydroxid- und Wasserstoffionen und reduzieren pH-Schwankungen bei der Verdünnung. Normalerweise liegt der pH-Bereich bei 2,00 bis 8,00 für RP-HPLC auf Packungen auf Kieselsäurebasis. Die Auswahl einer Pufferlösung richtet sich normalerweise nach dem bevorzugten pH-Wert. Wenn der PK A nahe am pH-Wert liegt, steuern die Puffer den pH-Wert am besten. Die am häufigsten verwendeten Puffersysteme für die Umkehrphasenchromatographie sind Phosphorsäure und ihre Kalium- oder Natriumsalze, Acetatpuffer, die auch häufig zur Trennung verwendet werden.

Der Phosphatpuffer ist ideal für die meisten HPLC-Trennungen, da er zwei pKa-Werte (2,1 und 7,1) und UV-Transparenz aufweist. Die Verwendung von Phosphatpuffer in LC-MS ist jedoch nicht geeignet, es werden flüchtige Puffersysteme bevorzugt, dh Acetat, TFA, Ammoniak und Formiat usw.

Pufferkonzentration: Eine höhere Konzentration des Puffers, die die Pufferkapazität erhöht, führt zu einer reproduzierbareren Trennung von teilionisierten Analyten beim pH-Wert der mobilen Phase, typischerweise ist eine Pufferkonzentration von 10 bis 50 mM für die Trennung von Komponenten ausreichend. Ein hochkonzentrierter Puffer verursacht einen hohen Rückraum für das System.

Puffer-pH-Wert: Die Retentionszeit ionischer Komponenten in der Umkehrphasenchromatographie wird im Wesentlichen durch den pH-Wert der mobilen Phase im Vergleich zu nichtionischen Komponenten beeinflusst. Im Allgemeinen beträgt der pH-Bereich der Pufferlösung oder mobilen Phase für die RP-HPLC 2,00 bis 8,00. Die Auswahl der Pufferlösungen wird üblicherweise durch den bevorzugten pH-Wert gesteuert.

Auswirkungen auf die Erkennung:Die Auswahl des Puffers hängt auch von den Detektionsmitteln ab. Für herkömmliche UV / VIS-Detektoren muss die Pufferlösung transparent sein, effektiv in diesem Bereich, was besonders wichtig für die Gradientenelutionstrennung ist.

Pufferlöslichkeit:Dies ist besonders wichtig beim Arbeiten mit der Gradientenelutionsmethode. Die Löslichkeit kann empirisch durch Mischen der angegebenen Volumenanteile des organischen Lösungsmittels und der Pufferlösung bestimmt werden. Das Vorhandensein von Fällungslösungen gibt an, dass die Löslichkeit mit dem Molekül und der mobilen Phase oder dem Lösungsmittel zusammenhängt. Generell gilt, dass die organische Phase 50% nicht überschreiten sollte, die mit dem Puffer verwendet werden sollte.

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