HPLC-Prinzip

HPLC-Prinzip ?

HPLC ist eine analytische Technik in der Chemie zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung des Probengemisches. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist heute eines der leistungsstärksten Werkzeuge der analytischen Chemie. Da es getrennt ist, identifizieren und quantifizieren Sie die in einer Probenmischung vorhandenen Analyten, die sich in einer Flüssigkeit lösen können.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Prinzip

Alle chromatographischen Trennverfahren wie Dünnschichtchromatographie (DC), Säulenchromatographie, HPTLC und Papierchromatographie funktionieren nach dem gleichen Grundprinzip. Die HPLC ist hauptsächlich eine hochentwickelte Form der Säulenchromatographie. Der HPLC-Prinzip basiert auf der Verteilung der Komponente zwischen einer stationären Phase (HPLC-Säule) und einer mobilen Phase (Lösungsmittel). Abhängig von der chemischen Struktur der Moleküle werden sie beim Passieren der stationären Phase verzögert. Die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Molekülen einer Probe und dem Verpackungsmaterial bestimmen ihre On-Column-Periode. Daher werden verschiedene Komponenten einer Probenmischung mit unterschiedlichen Retentionszeiten eluiert.

Prinzip und Ablauf der HPLC

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Diagramm

Verschiedene Arten von HPLC

Die folgenden Arten von HPLC basieren auf der stationären Phase im Prozess:

Normalphasen-HPLC: NP-HPLC trennt die Moleküle nach Polarität, wobei die polare stationäre Phase und die unpolare mobile Phase verwendet werden.

Umkehrphasen-HPLC: Die Umkehrphasenchromatographie arbeitet nach dem Prinzip der hydrophoben Wechselwirkungen. Je unpolarer der Analyt ist, desto länger bleibt er erhalten. Es ist diese mobile Phase polar und die stationäre Phase ist unpolarer Natur.

Größenausschluss-HPLC: Größenausschlusschromatographie (SEC) ist ein chromatographisches Verfahren, das Moleküle ausschließlich auf der Grundlage ihrer Größe trennt. Bei dieser Technik werden Moleküle durch das Säulenpackungsmaterial auf der Grundlage ihres Ausschlusses aus den Poren getrennt.

Ionenaustausch-HPLC: Es trennt die Ionen und polaren Moleküle basierend auf ihrer Affinität zum Ionenaustauscher. Die Ionenaustauschchromatographie ist die beliebteste Methode zur Reinigung von Proteinen und anderen geladenen Molekülen.

Versuchsdurchführung der HPLC:

Bevor wir mit einem HPLC-Experiment beginnen, müssen wir die verschiedenen Komponenten erkennen, die für die Durchführung des Prozesses wesentlich sind.

HPLC-Pumpe: Die HPLC-Pumpe erzeugt einen hohen Druck, der der mobilen Phase im gesamten HPLC-System einen kontinuierlichen und reproduzierbaren Fluss verleiht. Z.B. Kolbenpumpe, Spritzenpumpe und pneumatische Pumpe.

HPLC Mobile Phase: Es ist ein Lösungsmittel oder enthält eine Kombination von Wasser mit organischen Lösungsmitteln, eine ideale Menge einer wässrigen Lösung mit polaren Lösungsmitteln oder Mischungen von organischen Lösungsmitteln.

HPLC-Entgaser: Es ist ein Werkzeug zum Entfernen von Gas aus einer mobilen Phase, die in der HPLC verwendet wird.

Prinzip und Ablauf der HPLC

HPLC-Injektor: Ein Probeninjektor ist ein Gerät, mit dem Probenlösung in das HPLC-System injiziert wird. Z.B. Rheodyne-Injektor, Septum-Injektor und Stop-Flow-Injektor.

HPLC-Säule: Die Säule ist die Schlüsselkomponente der HPLC, da sie für die Trennung der Analyten des Probengemisches verantwortlich ist. Säulen sind jetzt für den Einsatz bei hohem Druck in Edelstahlrohren ausgelegt. Typischerweise wird Kieselgel in die als stationäre Phase bekannte HPLC-Säule gefüllt.

HPLC-Ofen: Es ist ein Gerät zur Steuerung der Temperatur einer Säule.

HPLC-Detektor: Ein Detektor ist ein Gerät zum Nachweis von Verbindungen, die von einer Säule getrennt sind. Der Detektor wandelt das Abwasser in ein elektrisches Signal um und wird vom Computersystem aufgezeichnet. Z.B. UV / VIS-Detektor, PDA-Detektor, Massendetektor (LCMS), Fluoreszenzdetektor und Infrarotdetektor usw.

Versuchsdurchführung für RP-HPLC:

1. Installieren Sie die Säule (C8 / C18) nach Bedarf ordnungsgemäß.
2. Bereiten Sie die mobile Phase vor und füllen Sie sie in das Reservoir. (Lösungsmittel, Puffer oder Kombination davon)
3. Bereiten Sie Proben nach Bedarf in verschiedenen Konzentrationen vor.
4. Erstellen Sie eine Methode und füllen Sie Parameter wie Flussrate, Zusammensetzung der mobilen Phase, Wellenlänge, Ofentemperatur und Programmzeit.
5. Erstellen Sie eine Sequenz für Proben und speichern Sie sie.
6. Spülen Sie das Reservoir für die mobile Phase, indem Sie das Spülventil öffnen.
7. Erhöhen Sie den Systemfluss schrittweise bis zur erforderlichen Flussrate und warten Sie, bis die Säule gesättigt ist und die Basislinie korrigiert ist.
8. Wenn Sie eine Basislinie erhalten, injizieren Sie die Probe manuell oder mit dem Autosampler über den Injektor (Probenschleife / Spritze).
9. Untersuchen Sie nach der Analyse der Probe die Retentionszeit, den Tailing-Faktor, den Kapazitätsfaktor und die theoretischen Böden jedes Peaks.
10. Wiederholen Sie den Vorgang entsprechend der Anzahl der Proben.
11. Waschen Sie die Säule gründlich mit HPLC-Wasser und Methanol / Acetonitril.

Hplc-Prinzip

HPLC-Anwendungen

1. Für pharmazeutische Anwendungen wird die HPLC zur Überwachung der Arzneimittelstabilität, Tablettenauflösungsanalyse der pharmazeutischen Dosisform und zur Qualitätskontrolle usw. verwendet.
2. Für Umweltanwendungen wird die HPLC zum Bio-Monitoring von Schadstoffen und zum Nachweis von Phenolverbindungen in Trinkwasser usw. eingesetzt.
3. Für forensische Anwendungen wird die HPLC zur Quantifizierung von Drogen in biologischen Proben, zur Bestimmung von Kokain, Steroiden und anderen missbrauchten Drogen in Blut, Urin usw. verwendet.
4. Für klinische Anwendungen wird die HPLC zur Analyse von Urin, Bilirubin, Antibiotika usw. verwendet. im Blut.
5. Für Lebensmittel- und Getränkeanwendungen wird die HPLC zur Analyse von polyzyklischen Verbindungen in Gemüse, zur Analyse von Konservierungsmitteln, Zucker und zur Messung der Qualität von Wasser und Erfrischungsgetränken eingesetzt.

Die Vorteile der HPLC sind wie folgt.

1. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bietet eine einfache, automatisierte und hochgenaue Methode zur Identifizierung bestimmter chemischer Komponenten in einer Probe.
2. Die HPLC liefert eine quantitative und qualitative Analyse, die einfach und genau ist.
3. Es kann auf Massenspektroskopie aufgerüstet werden.
4. Im Vergleich zu anderen chromatographischen Techniken wie Säulenchromatographie, DC und Papierchromatographie ist die HPLC schnell, effektiv und liefert eine hohe Auflösung.
5. Die Gradientenelution ist in der HPLC leicht anpassbar.

Prinzip und Ablauf der HPLC

Die Nachteile der HPLC sind wie folgt.

1. Dies erfordert eine große Anzahl teurer Lösungsmittel, Stromversorgungen und regelmäßige Wartung.
2. Muss Fachwissen sein, da es für Anfänger schwieriger ist.
3. Die Zuverlässigkeit des HPLC-Trennverfahrens hängt von der Sauberkeit der mobilen Phase, der Probe und dem ordnungsgemäßen Systembetrieb ab.
4. Die kontaminierte Säule kann die Peakformen beeinflussen.

Häufig gestellte Fragen zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie lauten wie folgt.

Was ist das Grundprinzip der HPLC?Das Grundprinzip der HPLC besteht darin, die Moleküle zwischen der stationären Phase und der mobilen Phase zu trennen. Da Moleküle unterschiedliche Verteilungskoeffizienten haben, werden sie auf dieser Basis getrennt.

Was sind die Arten von HPLC?Normalphasen-HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Größenausschluss-HPLC und Ionenaustausch-HPLC usw. sind die Arten von HPLC basierend auf dem Phasensystem (stationär) im Prozess.

Was ist der Hauptvorteil von HPLC?Einer der Hauptvorteile der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie besteht darin, dass sie eine Vielzahl von Proben testen kann.

Was ist der Hauptunterschied zwischen HPLC und HPTLC?Der Hauptunterschied zwischen HPLC und HPTLC besteht darin, dass die HPLC eine quantitative Molekültrennung in einem Probengemisch ermöglicht, während die HPTLC dies nicht zulässt.

Welche Vorsichtsmaßnahmen sind bei der HPLC-Analyse zu treffen?

• Stellen Sie sicher, dass die Säule vor und nach der Analyse gewaschen wird.
• Lösungsmittel müssen durch eine 0,5 µm Nylonfiltermembran gefiltert und entgast werden.
• Die Probe muss partikelfrei sein, also durch eine 0,2 µm Nylonfiltermembran gefiltert werden.
• Puffer wie Phosphatpuffer, Acetatpuffer usw. sind sehr schädlich für das HPLC-System und Säulen, die sie richtig gewaschen werden müssen.
• Überlasten Sie die Säule nicht.
• Verwenden Sie geeignete Durchflussraten, um den Systemdruck aufrechtzuerhalten.
• Betreiben Sie HPLC-Systeme nicht bei hohem Gegendruck.
• Verwenden Sie immer Lösungsmittel und Wasser in HPLC-Qualität, die aus zuverlässigen Quellen stammen.
• Verwenden Sie Schutzsäulen zum Schutz vor Kontamination und zur Verlängerung der Lebensdauer der Säule.
• Verwenden Sie keine mobile Phase oder Puffer mit einem stark sauren oder basischen pH-Wert.



Prinzip und Ablauf der HPLC

Verweis

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