Normalphasen-HPLC-Chromatographie Advance

Normal Flüssigchromatographie

Normalphasen-HPLC eignet sich gut zur Trennung der Phospholipide. Verschiedene Kieselgelsäulen liefern ausgezeichnete Trennungen der Hauptphospholipidklassen, die in vielen Fällen auch eine gut erkennbare Trennung der Nebenkomponenten ermöglichen. Abbildung 01 zeigt die Trennung, die mit einer Kieselgelsäule für die Ethanolamin-, Cholin-, Inositol- und Glycerolglycerophospholipide und Sphingomyelin erhalten wurde, isoliert aus einer Teilfraktion der humanen High-Density-Lipoproteinpräparation mit Online-MS-Detektion. Im positiven Ionenmodus werden nur die cholinhaltigen Phospholipide leicht nachgewiesen, obwohl die Ethanolamin-Glycerophospholipide auch bei geringer Intensität zu sehen sind. Die sauren Glycerin-, Inosit- und Serinphosphatide sowie alle Ethanolaminphospholipide werden am besten im Negativ-Ionen-Modus nachgewiesen. Der Negativ-Ionen-Modus registriert auch die Cholinphospholipide als Chloridaddukte. Es gibt eine vollständige Grundlinientrennung für alle Phospholipide ohne signifikante Auflösung von Molekülspezies, mit Ausnahme von SM, das in langkettige und kurzkettige Spezies getrennt ist.

Abbildung 01. Normalphasen-HPLC auflösung von Lipoproteinglycerophospholipiden hoher Dichte und Sphingomyelinen im (A) positiven und (B) negativen Ionenmodus, wie durch Online-Elektrospray-Massenspektrometrie aufgezeichnet. Die Peak-Identifizierung ist wie in Abbildung 1 angegeben; PAF, plättchenaktivierender Faktor. HPLC-Bedingungen: Säule, 5 µm Spherisorb (250×4,6 mm i.d.); Lösungsmittel, linearer Gradient von 100% A (Chloroform/Methanol/30% Ammoniumhydroxid 80:19,5:0,5, Vol.) bis 100% B (Chloroform/Methanol/Wasser/30% Ammoniumhydroxid 60:34:5,5:0,5, Vol.) in 30 min. (Unveröffentlichte Ergebnisse von Kuksis A und Ravandi A, 1997.)

Normalphasen-HPLC mit Online-MS können die in den einzelnen Phospholipidklassen vorhandenen Molekülspezies beurteilt werden. Es ist möglich, Einzelionenchromatogramme zu erhalten, die aus den gesamten positiven Ionenstromspektren für die Hauptmolekülspezies der Cholin- und Ethanolaminphosphatide gewonnen werden. In diesem Normalphasensystem wandert das neu identifizierte glykierte Diradylglycerophosphoethanolamin mit der Vorderseite des Phosphatidylcholinpeaks. Die Einzelionenchromatogramme, die vom Computer aus dem gesamten negativen Ionenstrom abgerufen werden, ermöglichen eine genaue Quantifizierung der wichtigsten Molekülspezies der sauren Glycerophospholipide.

Normalphasen-HPLC kann zur Trennung der Alkylacyl-, Alkenylacyl- und Diacylunterklassen der Ethanolaminglycerophospholipide als Trinitrophenylderivate verwendet werden. Die Diradylunterklassen der Cholinglycerophospholipide können nicht durch Chromatographie der intakten Ausgangsmoleküle getrennt werden. Zu diesem Zweck müssen Diradylglycerophosphocholine vor der HPLC-Trennung dephosphoryliert und die resultierenden Diradylglycerine in UV-absorbierende oder fluoreszierende Derivate (Tabelle 2) überführt werden, sofern kein ELSD-System verwendet wird. Die Molekülspeziestrennung der Diradylglycerine erfolgt durch Umkehrphasen-HPLC, wie für die von Triacylglycerinen abgeleiteten Diacylglycerine durch Grignard-Abbau beschrieben.

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